DevCellCell骨微环境增

撰文

张伟杰

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治疗抗性以及转移是癌症病人复发的主要原因。骨骼是乳腺和前列腺等癌症最常见的转移器官。大约65-75%的乳腺癌或前列腺癌病人尸检存在骨转移灶。对骨转移进一步深入研究的迫切需求显得十分矛盾。一方面，单发骨转移的病人具有明显更好的预后和生活质量。相比其他亚型，雌激素受体α阳性（ERα+,或者Luminal型）乳腺癌病人骨转移的比例更高，但同时也表现出更长的潜伏期。另一方面，接近一半的乳腺癌病人最先复发转移到骨，这一比例远高于其他内脏器官。相比其他器官转移，骨转移对辅助抗内分泌治疗和化疗不反应的比例更高。超过三分之二的骨转移病人最终会产生其他器官转移并死于多器官转移。

对骨转移的分子机制的认识主要集中在转移晚期阶段。以乳腺癌为例，肿瘤细胞通过旁分泌一系列如PTHrP,IL11等生长因子，调节成骨细胞分泌RANKL和OPG等溶骨因子的水平，从而促进了溶骨细胞的发育形成和溶骨活性。增强的溶骨过程又释放并激活了骨基质中储存的IGF，TGF-β和钙离子等促进肿瘤细胞生长的因子，从而形成viciouscycle促进转移进展。与骨转移的晚期阶段相比，受限于技术和模型，对于早期骨微小转移（Bonemicrometastases,BMMs）或者骨髓中散播肿瘤细胞（BMDTCs）的研究相对有限。早年的研究证实了肿瘤细胞可以在疾病发展非常早期的时候扩散到骨髓。临床上在未出现侵袭表型局部肿瘤的病人骨髓中也可以检测到DTCs。相比循环肿瘤细胞(CTCs)，BMDTCs能够明显抵抗辅助治疗，富集表达肿瘤干细胞标志物。而在ERα+病人中，相比原位肿瘤以及晚期转移灶，BMDTCs或BMMs缺失ERα或者呈现ERα表达水平的异质性。BMDTCs的存在不仅预示骨转移风险，也与较高的其他器官转移风险相关。这些临床观察的病理意义和潜在分子机制并不清楚。

年4月19日，DevelopmentalCell和Cell在线发表了来自美国休斯敦贝勒医学院张翔实验室题为ThebonemicroenvironmentincreasesphenotypicplasticityofER+breastcancercells和Thebonemicroenvironmentinvigoratesmetastaticseedsforfurtherdissemination的两篇论文。利用实验室早年发展的经股动脉注射（IIA）肿瘤细胞的早期骨转移模型，研究人员证实了与骨微环境的互作通过表观遗传学的重塑过程增强了肿瘤细胞的表型可塑性，从而抵抗内分泌治疗并且促进从骨转移对其他器官的继发转移。

在DevCell工作中，研究人员首先发现了与原位肿瘤和大的骨转移灶相比，ERα+PDX以及细胞系形成的BMMsERα蛋白水平明显下降。这个现象可能是肿瘤中的ERαhigh和ERαlow克隆在骨内生长速度不同导致,也可能是肿瘤细胞在骨转移早期经历暂时的ERα表达降低。所以作者利用遗传更均一的由单个MCF-7细胞克隆化生长形成的SCP2细胞重新证实了SCP2BMMs也呈现降低的ERα蛋白水平，说明ERα在骨转移早期适应性下降。PET-CT揭示在小鼠体内BMMs相比原位肿瘤对放射性标记的雌激素的吸收减弱，而晚期骨转移对雌激素的吸收与原位肿瘤相当。这些数据支持了ERα的丢失在骨转移进展过程中可逆。接下来作者结合近年来发展的由CRISPR-CAS9驱动的可持续演化DNA条形码系统（evolvingbarcodes,图1）以及激光显微切割研究了骨转移中各个克隆的演化关系，证实了ERα低表达的克隆能够产生ERα高表达的克隆。另一方面，利用带有ER响应元件（ERE）的GFP报告载体，作者发现ERE-GFPlow的肿瘤细胞具有更强的骨转移能力，并形成具有异质ERα表达水平的骨转移灶。

图1，inducibleevolvingbarcode，来自Zhangetal,Cell

研究人员发现与骨基质接触的转移灶边缘通常相比中央部分肿瘤细胞具有更低的ERα蛋白水平，所以猜测与骨内细胞的接触可能介导了肿瘤细胞ERα表达的下降。通过对多种骨内细胞的共定位染色，作者发现ERα表达水平与破骨细胞的共定位正相关，而与内皮细胞，成纤维细胞以及骨原细胞（osteogeniccells）的共定位呈明显负相关，其中以骨原细胞最明显。与骨原细胞的体外3D共培养能够显著地降低肿瘤细胞的ERα蛋白水平和活性。ERα的下降通常导致ERα+肿瘤细胞对内分泌治疗产生抗性。所以研究人员进一步在3D共培养系统中检测了肿瘤细胞对常见的内分泌治疗药物他莫昔芬（Tamoxifen）和氟维司群(Fulvestrant)的反应，结果显示与骨原细胞共培养明显削弱了Tamoxifen和Fulvestrant对肿瘤细胞生长的抑制作用。另外，体外培养的早期代数的从骨转移灶中提取出来的SCP2细胞（Bo-SCP2）具有对内分泌治疗药物的抗性，然而这一特征随培养代数增加而逐渐消失，说明抗性产生的机制并非克隆选择。在小鼠体内，早期骨转移并不能对雌激素剥夺产生明显反应，而在晚期可以恢复对雌激素剥夺的响应，说明骨微环境诱导产生的抗性在转移发展过程中可逆。结合之前的研究，实验显示阻断肿瘤细胞与骨原细胞之间的直接接触以及钙流通部分消除了骨微环境诱导的内分泌治疗抗性。

TRAP-Seq显示与骨原细胞的共培养引起肿瘤细胞广泛的翻译组水平的偏移，包括从luminal表型到basal表型的转变和上皮间充质转变（EMT），富集染色质表观遗传调控，干性（stemness），受体络氨酸激酶（RTK）等相关信号通路。RPPA蛋白组学检测发现boneentrained的肿瘤细胞下调了ERα通路，同时上调了干性，间充质标志物以及多个RTK的蛋白水平，说明骨微环境整体上诱导了luminal型肿瘤细胞去分化。值得一提的是，骨转移灶边缘肿瘤细胞同时表达上皮和间充质标志物（图2），提示骨微环境并不单纯地导致肿瘤细胞EMT,而是诱导一种hybridEMT状态。这种hybridEMT状态与肿瘤细胞的表型可塑性和干性相关。进一步的实验显示FGFRα和PDGFRβ在骨微环境中的表达上调介导了肿瘤细胞ERα+表达的下降和表型可塑性的获得。

图2，骨微环境诱导hybridEMT，来自Badoetal,DevCell

研究人员还发现FGFRα和PDGFRβ都可以调节组蛋白甲基转移酶EZH2的活性，而EZH2的表达水平在BMMs以及早期代数的boneentrained肿瘤细胞中高表达。利用小分子抑制剂EPZ抑制EZH2的活性可以显著增强ERα蛋白的表达。有意思的是，ERα-的鼠源乳腺癌细胞系AT3在体外经EPZ处理后可以表达ERα成为ERα+细胞系。在野生型小鼠中，ERα+AT3细胞在骨转移灶边缘中同样会出现明显的ERα表达下调，而在敲除osterix+成骨谱系的小鼠中这个现象消失了。最后作者在小鼠模型中评估了EPZ与内分泌治疗联用治疗骨转移的有效性。单独使用EPZ或者Fulverstrant都不能明显减缓骨转移的进展，而Fulverstrant联合三周的EPZ处理可以使50%的小鼠骨转移消失或者减缓其生长，证实了靶向EZH2可以逆转骨微环境导致的内分泌治疗抗性。

在Cell工作中，研究人员扩展了骨微环境重塑癌症转移的机制。首先，研究人员意外发现经IIA注射形成的多种乳腺癌和前列腺癌骨转移模型虽然早期转移灶局限于骨中，但晚期经常出现全身性的多器官转移。另外一种直接将肿瘤细胞接种于骨内的骨转移小鼠模型相同时间后也发展出相似程度的多器官转移。为了验证这种延迟的多器官转移是由初级骨转移继发扩散而不是由注射时从骨泄露的少量肿瘤细胞形成，研究人员设计一个对照试验将同等数量的肿瘤细胞直接注射入与股动脉并行的股静脉中。理论上，由于跳过了骨内血管对肿瘤细胞的捕获和富集，静脉注射将会使更多的肿瘤细胞送到小鼠身体的其他器官，尤其是肺，所以该对照也是一个实验性肺转移模型。同时研究人员也将同等数量肿瘤细胞接种在小鼠乳腺，观测原位肿瘤的转移发生情况。令人惊讶的是，经过相同时间后，相比骨转移模型，原位肿瘤或者股静脉注射形成的肺转移造成的其他器官转移明显更加稀少。骨转移模型在肺部肿瘤负荷的相对增长是直接肺转移模型的十倍以上，强烈支持骨微环境增强了继发转移。通过交叉播种（crossseeding）实验，作者发现同一动物体内原位肿瘤经常存在骨转移灶来源的克隆，而在骨转移灶中很少观察到原位肿瘤来源的细胞。同时利用共生（parabiosis）模型，研究人员观察到约25%与携带骨转移的小鼠共生的正常小鼠体内形成可被检测到的微小转移，而与携带原位肿瘤的小鼠共生的对照组小鼠均未出现转移，进一步支持骨微环境增强了肿瘤的转移扩散。

近年来对癌症病人不同部位的转移灶进行深度DNA测序并利用基因突变构建转移扩散历程的研究显示骨转移的确能够在临床上继发其他器官的转移。然而这是否可以在小鼠自发转移模型中实现？为了探讨这种可能性，研究人员首先利用先前提到的evolvingbarcodes系统标记肿瘤细胞。体外的诱导实验显示细胞群体中barcode的香浓熵（Entropy）与doxycycline诱导次数正相关。所以作者设计了一个自发转移小鼠模型，即将标记的肿瘤细胞种植到乳腺原位，一段时间后手术去除原位肿瘤并每周经腹腔注射一针doxycycline以诱导barcode的演化，并在6周后收集全身多个器官出现的转移灶。因为转移在远端器官定植是由少数肿瘤细胞完成，研究人员推断每一次转移播散中子代继承亲代肿瘤barcode的部分特征突变，而子代肿瘤初始Entropy会急剧降低，但会随着doxycycline诱导次数的增加而增加。所以作者认为可以通过检测barcode特征突变来确认演化上相近的转移，而各转移的Entropy可以用于指示转移出现的时间（图3）。

图3，利用evolvingbarcodes研究转移扩散,来自Zhangetal,Cell

对同一小鼠来源的不同转移的barcodes突变的非负矩阵分解（nonnegativematrixfactorization,NMF）分析揭示了一些对癌症转移新的认识。1）同一器官的转移并不都是来自于相同的祖先克隆，而最早发生的转移似乎都是由同一个克隆产生。这与传统观点认为转移具有器官偏好性相抵触。2）大部分转移通常有多个独立克隆组成,这可能是由clustermetastasis或者更复杂的crossseeding或者backseeding造成。3）小鼠模型自发转移过程中同样存在从骨到其他器官的继发转移扩散。4）转移灶的大小并不与转移形成的时间相关。亲代转移可以一直维持较小的肿瘤负荷，暗示临床无症状的转移也有可能继发扩散形成致命的转移（图4）。

图4，小鼠多器官转移barcodes组成,来自Zhangetal,Cell

遗传选择被认为是转移器官偏好性（organotropism）产生的机制,但实验中观察到骨转移导致的多器官转移并没有体现出器官偏好性，所以研究人员猜测骨转移继发转移过程可能涉及了与上文相似的表观遗传适应过程。作者将弱转移的的遗传均一的分别来源于MDA-MB-和MCF-7细胞的SCP21和SCP2细胞接种于乳腺，肺，骨等不同微环境中一段时间后取出体外培养扩大。早期代数的骨微环境来源的肿瘤细胞具有最强的转移形成能力，而且形成的转移并不局限于骨骼系统。boneentrained的细胞具有更强的干性标志物表达，并明显上调PDGFRβ，FGFRα，间充质标志物以及诱导EMT转录因子Slug和Zeb1而保持了上皮标志物的表达水平。这些数据都说明了相比乳腺和肺微环境，骨微环境增强了肿瘤细胞的表型可塑性和干性，而这又与其增强的转移能力直接相关。在小鼠模型中和病人样本中研究人员都发现骨转移来源的CTCs具有更高的干性标志物的表达。同样的，相比其他微环境，boneentrained的细胞具有更高的EZH2表达水平和活性。而骨微环境赋予肿瘤细胞的这些特征在体外培养中会渐渐失去，证实了骨微环境促进继发转移是可逆的表观遗传重塑而非克隆选择过程。在体外短暂地用EPZ处理boneentrained的肿瘤细胞可以显著降低肿瘤细胞的多器官转移能力。另外，在骨转移中特异性敲低EZH2表达能够显著地防止其继发转移，说明EZH2介导的表观遗传重塑过程是潜在的骨转移继发转移的治疗靶点。

综上，研究人员在两项研究中利用不同的模型揭示了肿瘤细胞通过非克隆选择机制适应骨微环境并获得抵抗内分泌治疗和继发扩散的能力，提示了骨微环境不仅是肿瘤细胞躲避辅助治疗的避难所，也是复发和转移所需‘种子’的孵育场。肿瘤细胞对辅助治疗的抗性和二次转移就如同一枚硬币的两面，其内在本质是微环境诱导的去分化和高可塑性状态。考虑到临床上大多数癌症病人原位肿瘤和浸润淋巴结在疾病诊断早期都已被手术切除，阻断早期骨转移与微环境的互作不仅可以消除局部复发，更有可能防止更为广泛并且致命的多器官转移。

来自贝勒医学院(BCM)的TheWilliamT.Butler,M.D.,EndowedChair，McNairScholar张翔教授是这两篇论文的通讯作者。IgorBado博士和张伟杰博士分别互为以上两篇论文的第一作者和共同第一作者，多位张翔实验室其他成员参与了研究工作。简和丹·邓肯神经学研究所（NRI）刘占东教授实验室负责了主要的生物信息学分析，其中胡靖远完成至关重要的evolvingbarcodes数据的分析。DevCell文章的工作同时得到了贝勒医学院RachelSchiff教授,黄仕霞教授，MatthewJ.Ellis教授,M.WaleedGaber教授和得州大学医学分部（UTMB）ZbigniewGugala教授等实验室的协助，而Cell文章主要合作者还包括贝勒医学院李毅教授，程崇惠教授医院研究所(HMRI)王天赐教授（StephenWong）实验室。

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